冻存细胞时,细胞内外环境中的水会形成冰晶。如果直接将细胞冻存到-196℃的液氮中,由于冻结过程中胞外溶液中的水先结冰,使胞外溶液不断浓缩,引起细胞电解质升高、渗透压改变、脱水及蛋白质变性等,会导致细胞受到机械性损伤。
在冷冻保存时,细胞外环境中的水会结冰。冷却速度的不同会导致细胞由于渗透脱水而发生不同程度的收缩。细胞外环境的渗透压随着水结成冰晶而不断升高,冷却速度越慢,细胞内水分通过渗透作用移出胞的时间就越长。因此,非常缓慢的冷却可能会导致细胞因过度脱水而死亡(A)。而快速冷却(C)会导致细胞内形成冰晶,这会导致细胞在复温时死亡。中间冷却速度(B)则可以平衡渗透脱水和细胞内结冰形成的风险,通常可以实现细胞存活率最大化。
如果在冻存液中加入保护剂(如DMS0),可使冰点降低,增加细胞渗透压稳定性。减缓慢速降温过程中的脱水皱缩现象,在缓慢冻结时减少冰晶的生成,使细胞免受损伤。
而在复苏时,需要快速升温,在1-2min内融化并稀释,这时细胞内外还来不及形成较大的冰晶,也不会使细胞长时间暴露在高浓度的电解质溶液中,从而避免细胞损伤,提高细胞存活率。
了解了慢冻快融的原理,还有哪些Tips可以提高冻存和复苏的成功率呢?那么冻存细胞的最佳时机是什么时候?什么样的细胞浓度合适?要用多少冻存液呢?怎么实现细胞的“慢冻”呢?
①最佳时机
细胞处于对数生长期,状态良好,且实验结果良好,此时的细胞最适合冻存。最好在复苏后两周内冻存细胞,留一部分细胞继续培养用于后续实验。
②冻存液
冻存液应于实验当天新鲜配制。常用的细胞冻存液配方为①培养基:血清:DMSO=7:2:1或②血清:DMSO=9:1DMS0是最常用的冷冻保护剂,5-10%的DMS0可用于大多数细胞的冷冻保存。DMSO有吸湿性,如使用DMSO作为冷冻保护剂,应将其储存于干燥环境中,避免使用开封1年以上的DMS0。冻存液中加入血清有助于解冻后的细胞恢复,但是随着无血清培养基的广泛应用,需要能够在没有血清的情况下冻存胞,不含血清的市售冻存液也是一个很好的替代选择。
③细胞浓度
建议细胞浓度为1x10cells/mL。根据细胞类型的不同,可扩展至5x105~1x107cells/mL。更高的细胞浓度并不会提高解冻后的活细胞数量,反而会由于高浓度引起的堆积效应而影响细胞活力。
④冻存液体积
常规2mL冻存管以1mL冻存体积为佳。不建议单个样本体积过大,否则会由于各部分冷却速度不一致而导致细胞活力受损。
⑤降温速度
对于大多数细胞,-1°C/min的降温速度能够极大保存细胞活力。可使用程序降温盒或梯度降温,推荐的梯度降温步骤为4℃20min→>-20℃30min→>-80℃过夜→液氮保存,亦可选用市售非程序性细胞冻存液,可直接存放至-80°C
⑥降温速度
短期可储存在-80℃,长期储存应保存在液氮中。长期存放于-80℃可能会降低细胞活力和功能。
⑦标记和记录
在冻存管上清楚标记细胞名称、代数、冻存人和冻存时间,并在记录本上登记细胞信息以及详细的存放位置,以便在复苏的时候正确拿取细胞。
复苏后第二天发现细胞没有活?好不容易复苏的细胞竟然污染了?怎么才能让细胞满血复活呢?
①细胞拿取
尽量减少样品从液氮或-80℃ 取出到放置在解冻装置中之间被动升温的时间,否则会大大影响细胞活力。如果储存装置和解冻装置相隔较远,可使用装有干冰(-80°C)或液氮(-196°C)的隔热容器临时保存和运送细胞。(注意:从液氮中取细胞时要佩戴护目镜和手套,谨防冻伤及冻存管爆炸!)
②解冻方式
a)解冻细胞时需要快速升温(50~100℃/min)才能最大保存细胞活力,最优的解冻方式是37℃水浴。从液氮或-80℃取出冻存的细胞后,稍拧松管盖,防止解冻过程中冻存管炸裂。放入37℃水浴中,持续摇晃1-2分钟直至解冻。
通常建议在可见冰融化但样品仍然冰冷(~0℃)时立即停止解冻,常见的做法是在只剩下一小片冰时从水浴锅中取出样品。升温至室温或更高温度会增加冷冻保护剂的细胞毒性,这会极大影响细胞活力。b)不建议室温解冻细胞,因为这会导致细胞死亡。
c)为降低污染风险,水浴解冻时冻存管管口要高于水面,避免水流入冻存管,水浴锅中的无菌水也要定期更换。
③稀释
解冻后应尽快稀释,以减少DMS0的细胞毒性。按照培养基:冻存液≥10:1的比例加入培养基进行稀释,然后离心并更换培养基重悬细胞,这样可以减少由渗透压变化导致的细胞应激。
④换液
依据细胞状态,在细胞贴壁后或24h后换液,继续培养。
Q:为什么我复苏的细胞完全不贴壁?
A:可能是由于细胞冻存前生长状态差或者复苏过程中动作慢,因此一
定要挑选生长状态良好、处于对数生长期的细胞进行冻存,操作过程要遵循“慢冻快融”的原则!
Q:为什么我复苏细胞的时候明明已经贴壁了,第二天再去看发现细胞全死了？
A:可能是细胞冻存之前消化过度,导致细胞凋亡,因此消化细胞时一定要严格控制消化时间哦!
Q:细胞复苏后只有非常少量细胞贴壁,是不是需要重新复苏?
A:先不要着急丢掉!可以补加血清和细胞因子,或者每隔2-3天换新鲜的生长培养基,经过2-3次换液后,大部分细胞就能看到明显增殖,此时再按照正常传代操作即可。当然,如果细胞库存充足,或者着急做实验,可以重新复苏一株细胞~
Q:冻存液配多了,不想浪费,可以留到下次用吗?
A:配好的冻存液在4℃可以暂存1周,在-20℃最多可保存一个月。不过最好还是现配现用、避免反复冻融。
