在变革B细胞恶性肿瘤治疗之后，CAR-T这辆“小车”又马不停蹄地向自免阵地驶去。
B细胞靶向CD19 CAR-T细胞疗法在系统性红斑狼疮（SLE）等自身免疫性疾病中的应用已经取得了令人信服的早期结果。以2024年为例：
- 2月21日，德国埃尔朗根-纽伦堡大学的GeorgSchett教授团队在NEJM杂志上报道了15例自身免疫性疾病患者（8例SLE、4例系统性硬化症和3例特发性炎性肌病）在接受CAR-T细胞疗法后重获新生，患者不再出现症状或不再需要进行新的治疗，其中第一批接受治疗的患者已经保持了两年多无病状态。
- 7月15日，海军军医大学长征医院/清华大学医学院徐沪济教授联合邦耀生物等合作伙伴在Cell杂志发表了通用型CD19 CAR-T细胞治疗3例难治性自身免疫性疾病患者的病例报道，其中1例为免疫介导的坏死性肌炎（IMNM）、2例为系统性硬化症（SSc）。结果表明，通用型CD19 CAR-T细胞在所有患者体内能够有效扩增和完全清除B淋巴细胞，3个月后实现B细胞的重塑。IMNM患者肌力显著改善，肌肉炎症明显缓解，自身抗体完全清除。SSc患者的皮肤软化，心肺等重要器官的纤维化也明显改善，且在6个月随访时持续改善。这是国际上首次报道异体通用型CAR-T治疗自身免疫性疾病。
- 7月24日，来自北京协和医院的研究团队在NEJM杂志报道了全球首次利用CD19 CAR-T治疗系统性红斑狼疮相关免疫性血小板减少症的病例：回输后CAR-T细胞在患者体内扩增良好，回输第28天血液中CD19阳性B细胞被清除，第三个月时B细胞重建。血小板计数治疗后的6个月内持续上升，达到临床完全缓解，且患者停用了糖皮质激素和所有免疫抑制剂。
除了发表在顶级期刊上的结果，CAR-T治疗自身免疫性疾病的代表性公司Kyverna Therapeutics今年3月29日也在Med上发表了利用CD19 CAR-T（KYV-101）首次治疗两例进行性多发性硬化症（MS，一种慢性神经退行性自身免疫性疾病）患者的积极研究结果。研究发现KYV-101在两例患者中均显示了可接受的安全性，尽管在脑脊液中检测到CD19CAR-T细胞，但未观察到免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)；此外，在病例1中，CAR-T细胞输注后脑脊液中鞘内抗体的产生显著减少，并持续到第64天。这些结果支持进行更大规模的临床研究来评估CAR-T疗法治疗MS的潜力。接连不断的临床喜讯使得CAR-T在自免疾病领域的研发愈发火热，近几年相关临床试验呈爆发式增长（上图）。近日，来自Kyverna Therapeutics及美国NCI的4位科学家在发表于Nature Reviews Immunology杂志上题为“Chimeric antigen receptor T cell therapy for autoimmune disease”的综述中指出，CAR-T细胞疗法有可能解决自身免疫性疾病的一系列致病机制，为这类疾病的治疗带来颠覆性的改变。来源：Nature Reviews Immunology在该文章中，科学家们系统总结了开发CAR-T细胞疗法治疗自身免疫性疾病的多项重要考虑因素，如哪种CAR结构最合适、何种程度的毒性是可接受的、是否需要预处理方案、是否可以实现持久的免疫重置或耐受。业界的共同期望是，CAR-T在自身免疫性疾病领域能够“大展拳脚”，带来新一轮的治疗变革。
CAR设计
CAR的关键组件（来源：Nature Reviews Immunology）CAR通常包括5个不同的结构域，每个结构域都可以经过设计以优化CAR-T细胞的功能。抗原识别结构域（antigen-recognition domain）通常是衍生自单克隆抗体单链可变片段(scFv)，作用是实现HLA非依赖性抗原识别。一个铰链结构域（hinge domain）负责将抗原识别结构域连接到一个跨膜结构域（transmembrane domain）上。CAR的细胞质部分通常包括一个共刺激结构域（co-stimulatory domain，例如衍生自CD28或4-1BB的结构域）及一个T细胞激活结构域（T cell activation domain，几乎都是衍生自CD3ζ）（上图）。不同类型CAR构建体（来源：Nature Reviews Immunology）除了这类单特异性CAR，一些其他CAR设计也正在开发中（上图）。例如，双顺反子CAR结构使得同一T细胞可以靶向两种抗原。与仅靶向CD19的CAR相比，同时靶向CD19（以清除B细胞和一些浆细胞）和BCMA（以清除长寿命浆细胞）的双顺反子CAR结构可能在消除自身免疫诱导抗体方面更优越。T细胞受体(TCR)融合构建体(TRuCs)涉及scFv结构域与αβ TCR亚基的融合。在体外实验中，表达TRuC的T细胞表现出与表达CAR的T细胞相似的肿瘤细胞裂解水平，但表达TRuC的T细胞释放的细胞因子水平较低，这可能导致临床毒性较小。“装甲”CAR是将CAR表达与另一种蛋白（如细胞因子）的表达结合在一起。这种途径（如CD19CAR结合IL-10表达）有望降低自身免疫性疾病活跃部位的炎症。此外，致病性自身抗体可以作为CAR的抗原识别结构域的靶点，形成嵌合自身抗体受体(chimeric autoantibody receptor，CAAR)。CAAR-T细胞只破坏产生自身抗体的B细胞，有望避免全身免疫抑制的副作用。一旦抗原被CAR抗原识别区域识别，表达CAR的T细胞就会表现出包括细胞因子释放、细胞毒性和增殖在内的功能。CAR-T细胞疗法遇到的一些问题包括，非特异性（非靶向抗原）识别、T细胞过度激活导致高水平细胞因子释放以及激活诱导细胞死亡和T细胞耗竭。在治疗自身免疫性疾病时，CAR的应用尤其需要限制细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性，以建立更高的安全性标准。以下具体讨论每个CAR结构域的相关注意事项：
抗原识别结构域是决定CAR靶抗原识别敏感性和特异性的主要因素。对于靶向恶性肿瘤的CAR，必须有一个具有足够亲和力的结合域，以实现CAR能够被低水平的目标肿瘤细胞抗原激活。抗原识别结构域同时必须具有足够的特异性，以避免与非靶向细胞上的抗原发生交叉反应，否则可能导致严重的毒性。
CD19和BCMA是治疗自身免疫性疾病被研究最多的两种靶抗原。当靶向CD19或BCMA时，导致组织损伤的非特异性CAR活性不是主要问题，因为许多靶向这些抗原的CAR在肿瘤临床试验中已被证明具有可接受的毒性水平。一个问题是，CAR的潜在免疫原性。事实上，在接受了CAR-T细胞输注后，在接受者中监测到了针对CAR构建体的体液和T细胞反应，可能是针对非人CAR组成，包括非人抗体序列、scFvs中的人工连接肽，以及各组成之间的连接（如CD28序列和CD3ζ序列之间的连接）。一份报告显示，体内抗体可能通过与CAR中的scFv结合阻断CAR-T细胞的功能。为了克服免疫原性，研究人员开发出了由来自全人源或人源化抗体的抗原结合域组成的CAR,，并已进入临床试验，但其优于小鼠scFvs的优势尚未得到证实。对于抗CD19 CAR，由于B细胞被根除，抗CAR免疫反应可能会减少，这可能会减少针对CAR的抗体反应。然而，值得注意的一点是，自身免疫性疾病患者容易对外来蛋白产生免疫反应。数据显示，虽然仅在1%的非霍奇金淋巴瘤患者中观察到利妥昔单抗（一种抗CD20人-鼠嵌合抗体)的抗药抗体，但这一比例在系统性自身免疫性疾病患者中达到14%，在SLE患者中达到37%。相比之下，针对atumumab（一种全人源抗CD20单克隆抗体）的抗药物抗体分别在0%和0.2%的癌症和多发性硬化症患者中被检测到。
CAR的铰链结构域和跨膜（hinge and transmembrane,HTM)结构域能够强烈影响其功能。研究人员比较了仅HTM结构域（来自CD8α或CD28）不同的抗CD19CAR，结果显示，与表达含有CD28 HTM结构域的CAR的T细胞相比，表达含有CD8α HTM结构域的CAR的T细胞在体外释放的毒性细胞因子水平较低。同样，临床试验结果显示，与含有小鼠scFv和CD28 HTM结构域(FMC63-28Z)的抗CD19CAR相比，含有人scFv和CD8α HTM结构域(Hu19-CD828Z)的抗CD19 CAR的神经毒性发生率要低得多(分别为5%和50%)。在接受表达Hu19-CD828Z的T细胞治疗的患者中，毒性的降低与免疫调节因子(如颗粒酶A和CC趋化因子配体2)血清水平的降低有关。此外，重要的是，接受Hu19-CD828Z或FMC63-28Z CAR-T细胞治疗的患者的抗淋巴瘤结果非常相似。在另一项临床研究中，具有更长的CD8α铰链结构域的CAR-T细胞没有显示神经毒性，且只有轻度(1级)CRS；疗效方面，抗淋巴瘤活性与历史对照相似。
CAR中CD28或4-1BB共刺激结构域的存在增强了它们的功能和抗肿瘤活性，这两个结构域在B细胞淋巴瘤中显示出相似的临床结果，包括淋巴瘤反应率和无进展生存期。有一些证据支持，相比表达含有CD28共刺激结构域的CAR的T细胞，表达含有4-1BB的CAR的T细胞在体内的持久性更长（没有进行正式的临床比较）。对于自身免疫性疾病，目前尚不清楚理想的共刺激结构域是什么，但CAR设计的一个主要考量可能是最小化毒性。
CD3ζ结构域是几乎所有临床使用的CAR-T细胞的激活部分。每个CD3ζ结构域包含三个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAMs)，这些ITAMs的磷酸化对T细胞激活很重要，但也可以诱导细胞凋亡。研究显示，失活三个CD3ζ ITAMs中的两个可以改善小鼠CAR-T细胞的存活，因为激活诱导的细胞死亡减少了。另有研究表明，使用CD3δ而不是CD3ζ可能有优势。在小鼠模型中，含有CD3δ的CAR显示出更好的抗肿瘤活性，并在体外减少了细胞因子的产生。
迄今为止，在大多数自免疾病临床试验中使用的CAR-T细胞疗法的CAR基因都是使用慢病毒载体转导到患者T细胞中的。慢病毒基因转导的一个缺点是，由于慢病毒基因插入的非靶向性，可能会导致插入性突变，这可能是在少数接受CAR-T细胞治疗的癌症患者中观察到的T细胞淋巴瘤发展的原因。一些靶向插入基因的方法已经被开发出来，例如利用CRISPR-Cas9系统将CAR基因插入到T细胞中的TRAC(编码TCRα恒定区)位点。靶向CAR基因插入途径在临床上的应用是一个活跃的研究领域。
闯荡自免江湖
在急性淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤中，抗CD19 CAR-T细胞疗法能够诱导B细胞的完全耗尽，这为使用抗CD19 CAR-T细胞治疗自身免疫性疾病提供了强有力的理论依据。然而，由于CAR-T细胞是由患者自身的淋巴细胞改造产生的，一个合理的担忧是转导了激活性CAR的自身反应性CD4 T细胞克隆会带来潜在的疾病增强效应。不过，在狼疮小鼠模型中的研究显示，只使用CD8 CAR-T细胞或者使用CD4 CAR-T细胞和CD8 CAR-T细胞混合物对于组织驻留B细胞具有同等有效的清除作用，均改善了疾病和小鼠生存。这些结果表明，自身反应性CD4 T细胞的转导可能不会限制CAR-T疗法治疗自身免疫性疾病的使用。
表1 部分已经发表的B细胞靶向CAR-T细胞治疗自身免疫性疾病的临床证据
来源：Nature Reviews Immunology
此外，最近有研究显示，由CD3淋巴细胞（unfractionated CD3 lymphocytes）开发的抗CD19 CAR-T细胞也显示出治疗自身免疫性疾病的潜力。一例20岁严重难治性SLE患者的病例报告就是一个值得注意的例子。患者有多种狼疮表现，多种免疫抑制剂（包括B细胞靶向生物制剂，如belimumab、rituximab）难以治疗。而输注自体抗CD19 CAR-T细胞导致疾病表现快速得到解决，重要的是，治疗耐受性良好，没有CRS或神经毒性的证据。同一研究中的其他4例难治性SLE患者疾病情况也显示类似速度的缓解（均在3个月内达到缓解），且相比治疗肿瘤安全性特征更胜一筹。在所有5个病例中，外周B细胞在CAR-T输注后的几个月内被耗尽到无法检测的水平，大多数致病性自身抗体降低到正常水平。同样，其他报道显示，CAR-T细胞治疗难治性抗合成酶抗体综合征、系统性硬化症和重症肌无力患者也取得了显著的疗效。在这些患者中，CAR-T细胞也具有良好的耐受性。在多发性硬化症中，CAR-T细胞疗法同样显示了良好的耐受性及潜在的疗效。这些结果支持利用CAR-T清除B细胞群以治疗不同B细胞驱动自身免疫性疾病更进一步的研究。这类细胞疗法有望实现自身免疫性疾病前所未有的的控制水平。部分正在进行的CAR-T细胞治疗自身免疫性疾病的相关临床试验见表2。
表2 部分正在进行的抗CD19和抗BCMA CAR-T细胞治疗自身免疫性疾病的临床试验
注：该综述上线日期为2024年6月3日，数据或有更新（来源：Nature Reviews Immunology）
接受CAR-T细胞治疗的自身免疫性疾病患者发生CRS和ICANS的风险在很大程度上仍然未知。由于自身免疫性疾病患者无恶性肿块或恶性细胞骨髓浸润（均与CRS和ICANS相关），因此与接受CAR-T细胞治疗的恶性肿瘤患者相比，他们的毒性可能更小。一些早期利用CD19 CAR-T治疗自身免疫性疾病的研究支持这一假设。到目前为止，由CRS、ICANS和血细胞减少引起的毒性病例的级别较低，而且很容易利用标准治疗加以控制。肿瘤CAR-T细胞治疗后感染很常见，已上市产品的临床试验中，有5%-32%的患者报告了3-5级感染。在自身免疫性疾病患者中，迄今为止的研究结果表明，更轻的细胞毒性治疗史以及更早、更连续的B细胞补充，可能有助于这类患者治疗后感染风险更低。因此，对于自身免疫性疾病患者来说，与需要长期给药导致外周血B细胞数量持续降低（导致感染风险增加）的抗B细胞单抗相比，抗CD19 CAR-T细胞引发的深入但短期的B细胞清除可能会带来可接受的、具有优势的安全性。
在CAR-T治疗自免疾病方面，一个值得关注的问题是，抗CD19 CAR-T细胞会消耗大量的B细胞，其中包括自身反应性B细胞和非致病性B细胞，这会使患者处于感染的风险中，直到B细胞恢复。为了更有选择性地清除自身反应性B细胞，有研究团队设计了CAAR-T细胞。CAAR全称为chimeric autoantibody receptor，包含一个由自身抗体靶蛋白（自身抗原）组成的胞外结合域。在寻常型天疱疮和MuSK重症肌无力小鼠模型中开展的临床前研究为CAAR-T细胞疗法提供了概念验证。名为Cabaletta的公司正在进行CAAR-T治疗粘膜性天疱疮（NCT04422912）和MuSK重症肌无力（NCT05451212）的I期临床试验。Treg细胞恢复免疫稳态的治疗潜力一直被看好。Treg细胞通过多种机制抑制炎症和自身免疫，包括通过表达negative调节性细胞表面受体产生直接的抑制性细胞-细胞相互作用，或者通过产生抑制性可溶性介质（如IL-10、TGFβ）间接发挥作用。使用体外扩增多克隆Treg细胞的临床研究表明，它们在患有各种自身免疫性疾病的患者中具有良好的耐受性，在移植后至少在循环中持续存在1年。不过，到目前为止，这类疗法尚未显示令人振奋的临床疗效。相比之下，抗原特异性Treg细胞更有效，在小鼠模型中表现出改善的功能（抗原特异性靶向Treg细胞可以通过更少的细胞带来有效的局部免疫调节作用，同时潜在地减少更广泛的免疫抑制）。Treg细胞可用于控制多种靶细胞。例如，尽管B细胞消耗一直是抗CD19 CAR-T细胞疗法的主要目标，但控制自身抗体的产生也可以通过抗CD19 CAR-Treg细胞方法来实现，且这种方法不需要完全清除靶细胞群（Treg细胞抑制免疫系统以恢复体内平衡，而大多数CAR-T细胞的功能是破坏目标细胞）。有研究显示，源自人类外周血单核细胞的抗CD19 CAR-Treg细胞移植到免疫缺陷小鼠中后，能够通过TGFβ依赖性机制抑制IgG抗体的产生和B细胞的分化。小鼠抗CD19 CAR-Treg细胞也能抑制急性移植物抗宿主病，同时维持移植物抗肿瘤反应。
与CAR-T细胞疗法相比，CAR-Treg细胞疗法CRS风险很小，因为稳定的Treg细胞不产生促炎细胞因子。开发工程化Treg细胞的一个关键考虑因素是确保调节性表型（regulatory phenotype）的稳定性，以避免转化为效应T细胞（ex-Treg细胞）。Treg细胞的稳定性与FOXP3的稳定表达和X染色体Treg细胞特异性去甲基化区域的去甲基化相关。科学家们正在寻求多种方法来开发稳定的CAR-Treg细胞，例如在强启动子的控制下增强FOXP3的表达，或通过基因编辑方法实现FOXP3的异位表达。
Treg细胞在1型糖尿病（T1D）中的作用已被广泛研究。有研究表明，靶向胰岛抗原的CAR-Treg细胞在预防T1D方面取得了显著的效果。此外，CAR-Treg细胞疗法在炎症性肠病、多发性硬化症等疾病中的应用也有报道。一家名为Sonoma的公司的具体思路是通过CAR将Treg细胞引导到炎症“热点”。该公司的主要资产SBT-77-7101可识别瓜氨酸化蛋白，这些修饰蛋白存在于炎症部位，如类风湿关节炎患者的关节和化脓性汗腺炎患者的皮肤结节。SBT-77-7101正处于治疗这两种疾病的I期临床试验中。
尽管使用不同的CAR共刺激结构域在CAR-T细胞疗法的临床结果方面没有明显差异，但CD28共刺激在Treg细胞发育中起关键作用，CD28在CAR-Treg细胞功能中比4-1BB更重要。与CD28相比，含有4-1BB的CAR-Treg细胞表现出谱系稳定性下降和体内抑制能力下降。不过，也有研究表明，表达带有或不带有CD28结构域的CAR的Treg细胞在功能上是相同的。对这方面的理解仍在不断更新。Treg细胞同样可以被改造以表达额外的细胞表面蛋白或可溶性蛋白，如趋化因子受体、细胞因子（如IL-10）或者FOXP3等(下图)。有研究显示，同时能够表达IL-10的CAR-Treg细胞，会导致IFNγ、IL-2、IL-17、IL-4和肿瘤坏死因子显著减少或清除。
工程改造Treg细胞（来源：Nature Reviews Immunology）
其他要点
在治疗癌症时，通常认为有必要在CAR-T细胞治疗之前进行条件化疗（常用的是低剂量环磷酰胺-氟达拉滨方案），以通过多种机制确保输注的CAR-T细胞的疗效，包括清除Treg细胞、骨髓来源的抑制性细胞，以及增加血清细胞因子（如IL-15和IL-7）的可用性。自身免疫性疾病患者的最佳化疗调节方案尚不清楚，但环磷酰胺-氟达拉滨已成功应用于抗CD19 CAR-T细胞治疗自身免疫性疾病。这种组合通常耐受性良好，最常见的化疗相关不良事件是轻度恶心、疲劳和血细胞减少。不过，环磷酰胺是已知的继发性髓系恶性肿瘤的促成因素，并能够损害生育能力，这对于患有自身免疫性疾病的年轻，主要是女性患者群体尤其值得关注。此外，罕见的氟达拉滨相关视力丧失也有报道。考虑到与肿瘤适应症相比的获益-风险差异，有必要研究用于自身免疫性疾病的毒性较小的调理方案。
值得一提的是，用于治疗慢性自身免疫性疾病的免疫抑制药物可能会干扰CAR-T细胞的生产和功能，因此需要在采血和CAR-T细胞输注之前减少用药或停药。对于疾病活跃的患者，完全不用可能不行，可以使用低剂量类固醇。最近，有证据表明，一些类固醇可以耐受，且不影CAR-T细胞的抗肿瘤作用。
通过CAR-T细胞疗法全面消除致病B细胞可能允许免疫系统“重置”。目前的证据表明，尽管B细胞恢复，疾病的改善仍可能维持。在首次报道的5例接受抗CD19 CAR-T细胞治疗的SLE患者中，naïve B细胞平均在110±32天后恢复，但在CAR-T细胞输注后长达12个月的随访中，没有患者报告疾病复发。值得一提的是，自身免疫性疾病患者的B细胞相对较早“恢复”，而肿瘤患者的B细胞可能在中位时间12个月后（范围为2-59个月）恢复，部分原因可能是由于自身免疫性疾病患者先前接受的清淋和抗CD20治疗更少。值得注意的是，抗CD19 CAR-T细胞输注后观察到的重新出现的B细胞的naive表型与清髓调节和自体造血干细胞移植后报告的类似。
小结
CAR-T这辆“小车”自2017年8月正式“上路”以来一直备受瞩目，其“治愈”癌症的潜力也推动了CAR-T研发的产业热潮。而最近两三年的研究成果显示，除了癌症，CAR-T在自免领域也有望掀起治疗变革。与单抗疗法相比，CAR-T细胞能够更加彻底地清除组织驻留的B细胞，从而带来多种自免疾病的持久缓解，这将是相比传统疗法的巨大进步。
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[1]https://www.nature.com/articles/s41577-024-01035-3
[2]https://www.nejm.org/doi/10.1056/NEJMoa2308917[3]https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(24)00701-3[4]https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMc2403743[5]https://mp.weixin.qq.com/s/RpyB_1OMoCCgdx_dyuOxhw[6]https://ir.kyvernatx.com/news-releases/news-release-details/first-disease-
