纳米抗体│临床级，应用于流式检测领域，优势多多
2022-08-15 09:56:18
骆驼科动物(骆驼，大羊驼，羊驼及其近亲物种)体内存在一种天然缺失轻链和重链CH1恒定区的重链抗体(HCAbs)，它由重链的CH2与CH3恒定区、铰链区和重链可变区(VHH)构成。
VHH保留了完整的抗原结合能力，该可变区可以单独稳定的在体外存在，被称为纳米抗体（Nanobody, Nbs）。纳米抗体晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KD。纳米抗体是由比利时科学家于1993年在自然杂志中首次报道。
纳米抗体的分子量只有传统的十分之一左右，可以在磁珠上包被更高密度的抗体，没有Fc段的干扰，特异性更强，因而可以检测更低丰度的特异抗原。
纳米抗体具有相对分子质量小、人源化简单、亲和力高、稳定性高、可微生物表达、免疫原性低、穿透力强、可溶性好等优势。
重链可变区VHH可溶性极高，不易聚集，能耐高温、强酸、强碱等致变性条件，适合于原核表达和各种真核表达系统，广泛用于开发治疗性抗体药物、诊断试剂、亲和纯化基质和科学研究等领域。
基于纳米抗体的优势，开发了体外诊断方法：
1 基于ELISA（双抗体夹心法，竞争法，间接法）检测体液抗原，小分子，毒素、毒品等；
2 流式细胞术检测表面标志物；
3 PET-CT成像，药物分布，药物靶点分布、药物有效性等。
Immunoway按照临床级别研发纳米抗体，并应用于流式检测领域。
纳米抗体由4个保守序列和3个互补决定区组(Complementarity-determining region， CDR)，纳米抗体的CDR3含有16-18个氨基酸残基，比人和鼠的VH（分别有12和9个氨基酸残基）更长，并且可以形成凸环结构，使得纳米抗体更容易与抗原结合，且由于体积小，能够结合到一些比较难结合的表位。
单核细胞、B细胞、DC细胞、NK、巨噬细胞、粒细胞、肿瘤细胞等高表达 FcR(Fc receptor, Fc受体），在检测这些细胞时，会与抗体的Fc段非特异性结合，产生假阳性信号。因此，流式检测这些细胞时，会推荐使用相应物种的血清或者商品化的Fc受体封闭剂。
纳米抗体没有Fc段的干扰，流式检测时无需进行Fc受体封闭。
纳米抗体VHH由于其FR2中的疏水残基被亲水残基所取代，使得纳米抗体的水溶性比普通单抗要高，且聚合性减少，因此在做多价抗体上更有优势。纳米抗体具有独特的理化性质，内部存在二硫键，抗热能力大大提高，能够在高温（90℃）环境下长期放置，并可重新获得生物活性，高耐性。可以在极端条件下，如高压或酸性下依然维持活性，并有可逆的去折叠能力，易复性。
纳米抗体结构简单，由单一基因编码，具有亲水性和单多肽性质，且没有糖基化，可以在细菌或者酵母菌中重组表达大量生产，抗体批次间稳定性好。并且在生产、运输、保存等方面更具备产业化的优势。
驼源抗体文库主要是指利用驼源重链抗体的可变区，即VHH区域序列构建的VHH抗体文库，又叫纳米抗体文库。
纳米抗体的制备先通过免疫羊驼/骆驼来获得抗体基因，然后通过噬菌体展示筛选技术从羊驼/骆驼抗体库中筛选到最适合的抗体序列。整个流程主要包括羊驼/骆驼免疫，噬菌体文库构建及筛选，纳米抗体表达纯化及验证等阶段。
免疫流程：准备抗原→免疫羊驼/骆驼→采血→血清分离→分离淋巴细胞。
构建噬菌体文库流程：RNA提取→反转录cDNA→扩增抗体片段→克隆至噬菌体质粒→转化→扩增和纯化噬菌体文库。
噬菌体文库的筛选流程：纳米抗体文库筛选→鉴定→挑选阳性克隆进行基因测序。
抗体筛选鉴定流程：从已测序的结合噬菌体中，挑取不同序列的噬菌体→抗体可溶性表达→纯化→鉴定。
PD1纳米抗体做流式间接检测：
样本：293T对照（左），PD1过表达293T(右)；
添加PD1纳米抗体0.5μL（0.5mg/ml）,孵育20min洗涤后再加yf647-his单抗1μL，孵育20min，流式检测。
注：PD1纳米抗体带有His标签。
结果显示PD1纳米抗体流式检测结果呈强阳性。
PD1纳米抗体做YF647标记后进行流式检测
不同克隆编号为：
0225HPD1-21
0225HPD1-22
0225HPD1-23
0225HPD1-42
0225HPD1-43
样本：mix诱导24h的 molt-4细胞；
添加纳米抗体0.5μL（0.5mg/ml）；
阳性对照：YF647标记的阳性对照。
结果显示0225HPD1-21 PD1荧光标记纳米抗体流式检测结果阳性。
0225HPD1-21 PD1荧光标记纳米抗体做进一步流式检测：
样本：mix诱导24h的 molt-4细胞；
添加纳米抗体0225HPD1-21 0.5μL（0.5mg/ml）；
阳性对照：YF647标记的阳性对照；
阴性对照：
1 0225HPD1-21未添加荧光标记抗体0225HPD1-2；
2 Human PD1-1,PD1-2,PD1-3,PD1-4 0.5μL（0.5mg/ml），不添加染料；
3 不添加任何抗体。
结果显示PD1荧光标记纳米抗体流式检测效果较好，和阳性对照结果较为一致。纳米抗体荧光标记及检测持续优化中。
Immunoway纳米-流式抗体部分已上市，更多纳米-流式抗体在研中，共同期待。
以为相关超链接：
抗体│Immunoway纳米抗体系列
公司简介：
ImmunoWay Biotechnology Company（简称Immunoway）公司成立于2002年，于2012年在美国德克萨斯州注册品牌。
自公司成立一直专注于抗体的研发和生产，抗体种类达18000+，单克隆抗体种类2000+，多克隆抗体15000+，二抗1000+，检测液态样本Elisa试剂盒700+，检测细胞样本Cell-Based Elisa Kits3000+，满足广大科研用户的使用和需求。
公司于2014年投入研发免疫组化专用抗体，国际单克隆抗体著名专家指导研发，免疫原针对免疫组化实验而设计，单克隆细胞株的筛选，抗体的验证均经过千张阳性切片和阴性切片检测，明确组织定位和亚细胞定位，抗体特异性强，灵敏度高，低背景，按照体外诊断试剂备案和注册要求研发生产。临床免疫组化应用于病理的辅助诊断和鉴别诊断，为疾病治疗提供客观的指导方案。目前抗体种类已近200种，覆盖肿瘤病理诊断，如乳腺癌，宫颈癌，结肠癌，胃癌，肝癌，淋巴瘤，前列腺癌，甲状腺癌等所需检测指标的绝大部分。
公司2022年新增基因工程纳米研发生产平台，陆续推出纳米抗体产品，用于治疗性抗体药物、诊断试剂、亲和纯化基质和科学研究等领域。新增流式抗体研发和生产平台，抗体荧光标记等，满足临床和科研用户流式细胞分析实验需求。
Immunoway将不断研发和生产出优质的抗体及相关产品，为临床和广大科研工作者提供更好的工具，共同服务于生命科学。
