一．NK细胞与肿瘤

NK细胞在20世纪70年代首次被确认为一种独特的淋巴亚型细胞，能够在没有预先致敏或检测特定肿瘤抗原的情况下识别并快速杀死异常细胞，从而能够起到抗肿瘤作用。目前，基于自然杀伤（NK）细胞的免疫疗法已成为癌症免疫疗法（无论是实体瘤还是血液恶性肿瘤）中一个有前途的前沿科学研究课题。NK细胞是具有广谱杀伤能力的先天性淋巴细胞，包括抗癌，抗病毒和抗移植物抗宿主病（GVHD）功能。激活的NK细胞可以通过直接细胞毒性和/或产生促炎细胞因子来杀死癌细胞。除了释放穿孔素和颗粒酶以消除肿瘤细胞外，NK细胞还通过膜受体CD16或由Fas配体（FasL）或TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）介导的凋亡途径发挥抗体依赖性细胞毒性（ADCC）（图1）。

图 1NK细胞对肿瘤的细胞毒性机制。1.通过NK膜表面的Fc受体CD16在NK细胞杀伤肿瘤细胞中起到重要作用，NK细胞通过膜受体CD16或通过FASL和TRAIL介导的凋亡途径引发ADCC。2.诱导NK细胞向一种或多种TAAs的BiKE和TRiKEs是治疗实体瘤的可行策略;3.CARs将NK细胞重新定向到具有特异性抗原的肿瘤细胞上，能够精准清除肿瘤细胞。

二．不同来源NK细胞

体外获得大量高纯度NK细胞是实现利用NK细胞用于临床治疗疾病的前提，目前可以从脐血，NK细胞系，外周血，ES 细胞系以及IPS细胞系在体外扩增获得大量高纯度NK细胞，并且可以通过基因操作用于产生CAR-NK细胞用于临床治疗（图2）。

图2 NK/CAR-NK细胞的来源和生成过程。从各种来源（例如，PB、UCB、HSC、hESCs 和 hiPSCs）分离或建立的 NK 细胞可以使用表达 CAR 的载体（例如慢病毒或逆转录病毒）进行激活和基因修饰，然后在 NK 细胞特异性扩增培养基中培养细胞因子，GMP 级制备的NK/CAR-NK可以用于临床研究和治疗。

各种不同来源nk生成体系有着各自不同的特点：1. 外周血来源NK细胞相对较容易获得，经过多年研究发展，目前从外周血高效扩增可以获得大量高纯度NK细胞体系已经成熟，但相对较低的转染效率可能会限制了它们的使用。2.hiPSC来源NK解决了ES细胞面临的伦理问题，目前从hiPS体外生成NK细胞技术体系已经建立，且易于基因编辑，但较低的扩增能力限制了该技术方法在临床上的转化应用；3. 从脐血MNC获得高纯度NK细胞体系也已经建立，UCB-NK具有更大的增殖能力，第一个CAR-NK临床试验使用的就是脐血来源的NK细胞。虽然有争议，但脐血来源NK细胞普遍认为比外周血来源NK细胞具有较低杀伤活性。4. NK92等细胞系来源NK细胞相对容易进行培养和基因编辑，但存在与安全问题相关的挑战，并且它们在回输前必须进行辐照阻碍了它们在宿主中存在的持久性。5.最后，NK细胞可以从BM或UCB的CD34阳性细胞产生。这些细胞通常类似于PB-NK细胞，并显示出确切清除白血病细胞和患者肿瘤细胞的能力，但需要分选CD34+细胞通常推高了制备成本，且体外培养技术难度更高。

综上所述，虽然NK细胞有多种的来源，但从成本和安全性考虑，目前以从外周血和脐血来源的NK能够更适合临床应用的预期，本文从脐血来源NK

（UCB-NK）和外周血来源NK（PB-NK）细胞表型，分泌因子以及细胞毒性等方面进行比较。

三．UCB-NK和PB-NK细胞表型比较

来自UCB和PB的NK细胞免疫表型的比较显示出许多相似之处。例如，主要的NK细胞亚群，CD56^high和 CD56^dim细胞在UCB和PB中以相同的比例存在。一些研究表明，NK细胞触发受体（Triggering Receptor）的表达，包括CD94，杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR;CD158a / h和CD158b / j），NKp46和NKG2D在UCB和PB NK细胞之间没有差异，但也有一些研究表明UCB和PB NK细胞的某些细胞表面markers也存在显著差异：来自UCB的NK细胞的较低比例细胞表达L-选择素（CD62L），可能表明淋巴结归位能力降低。同样，许多粘附分子，包括CD2，CD11a，CD18和CD54，存在于较低百分比的UCB NK细胞上。与PB NK细胞相比，更多的UCB NK细胞表达 Toll样受体4（TLR4），其介导对脂多糖的先天性炎症反应，尽管没有研究比较这两种NK细胞来源对脂多糖的反应。一些研究人员还发现，较少的UCB NK细胞表达与终末NK细胞成熟相关的受体，包括CD8和CD57（图3）。基于此，人们很容易推测UCB NK细胞可能不如PB NK细胞成熟。然而，两者的成熟度必须结合其他更多因素考虑，因为UCB衍生的NK细胞也表达相同或更高水平的效应分子，包括穿孔素和颗粒酶B，它们也与NK成熟有关。

在UCB的淋巴细胞门内，可以根据CD45表达观察到两部分细胞。更具体地说，UCB包含CD45^dim和 CD45^high淋巴细胞群，而只有后者在成人PB中发现。CD45表达减少的意义尚不清楚，需要做更多的工作来研究这两个群体之间的差异。在UCB中可以找到许多NK祖细胞群，这些种群通常不存在于PB中。这些群包括CD34−CD133−CD7−CD45+lin−细胞群，该群细胞用白细胞介素IL-15和基质细胞（stromal cell）培养后可以分化成NK细胞。更进一步 CD34+CD7+ 和 CD34-CD7+祖细胞（progenitor cell）在UCB中也更丰富，这些细胞也能够发育成NK细胞。还有一些存在于UCB中的祖细胞群也被描述，包括CD34−CD56−这一群贴壁细胞显示多种不同表面markers（CD14、CD11b、CD13 和 CD33）的异质表达。当这一群细胞使用FLT-3配体（FLT-3L）和IL-15培养时，这些细胞显示出CD14的进行性丢失，逐步表达CD56和其他NK细胞受体。

而CD56^high和 CD56^dimNK细胞亚群在UCB和PB中以大致相同的比例存在，其他NK细胞群，如CD56−CD16+在UCB中更丰富。CD56−CD16+细胞在免疫受损宿主中以更高的频率发现，包括那些患有慢性病毒感染的宿主（人类免疫缺陷病毒和丙型肝炎。这群细胞使用IL-2和/或IL-15进行培养可以逐渐表达CD56，表明它们可能是NK祖细胞。与此相一致，UCB来源的CD56-CD16+ NK细胞具有较差的细胞毒性，但在IL-2或IL-15刺激后增强。更有趣的是，CD56−CD16+细胞在使用UCB的同种异体HCT后被鉴定出来，但在BM或PB移植后没有。

图 3UCB-NK细胞和PB-NK细胞表型的差异。与PB-NK细胞相比，UCB-NK细胞的CD16，CD2，CD11a，CD18，CD62L，KIRs，DNAM-1，NKG2C，IL-2R，CD57和CD8的表达水平较低，NKG2A和CXCR4的表达水平较高。

四．UCB-NK和PB-NK分泌细胞因子比较

先前比较UCB和PB T细胞的研究表明，有丝分裂原刺激后UCB T细胞的细胞因子包括GM-CSF，TNF-α，IFN-γ分泌减少。这归因于UCB T细胞中NFAT1表达较少。虽然没有研究解决UCB NK细胞中的NFAT水平，但与PB NK细胞相比，来自UCB的NK细胞也显示出较低比例的TNF-α产生细胞。

CD56^highNK细胞是IFN-γ的重要来源，诱导NK细胞中IFN-γ产生的一种既定方法是用IL-12和IL-18刺激。比较IL-12和IL-18诱导的UCB和PB NK细胞的IFN-γ反应表明，来自UCB的NK细胞产生显著更多的IFN-γ。同样，UCB-NK细胞在IL-12和IL-18刺激后显示出更多的CD69表达，表明UCB NK细胞在因子作用下能够更好的激活。

五．UCB-NK和PB-NK细胞毒性比较

许多研究表明，与PB MNCs相比，静息UCB单核细胞（MNCs）具有较低的细胞毒性。然而，用lL-2，IL-12或IL-15刺激UCB和PBMC,诱导获得的NK细胞杀伤能力相当，最近使用纯化的NK群体的研究证实了这些发现。与未分离的MNC研究一样，在IL-2和IL-15刺激后，纯化的UCB NK细胞毒性可以显著增加。使用其他细胞因子的实验，包括IL-12或IL-18单独或与其他细胞因子组合，显示出类似的效果（增加UCB细胞毒性）。因此，虽然毫无疑问，静息UCB衍生的NK细胞具有较低的体外细胞毒性，但它们对细胞因子刺激迅速作出反应，导致与来自成人PB的类似处理的NK细胞具有相同的细胞毒性作用。

CD56^high和 CD56^dimNK细胞亚群在功能上的不同已经很好的被鉴定。CD56^high和 CD56^dimNK细胞亚群百分比在UCB和PB中的NK细胞是相似的，比较这两个NK亚群的细胞毒性的研究揭示它们有相当大的差异。纯化的来自UCB和PB的CD56^highNK细胞具有低细胞毒性，这在UCB和PB中是相似的。但对于纯化的CD56^dimNK细胞，PB中的CD56^dimNK细胞相比UCB的CD56^dimNK细胞显示出明显更强的杀伤作用。这也是为什么普遍认为UBC-NK细胞比PB-NK具有更低细胞毒作用的原因。

虽然上述UCB-NK细胞尤其是CD56^dimNK细胞杀伤较低的原因尚不清楚，但UCB和PB NK细胞之间存在一些差异可以部分解释这些差异。在测试NK细胞对K562细胞结合杀伤的实验测定中，与PB-NK相比，UCB-NK细胞与靶细胞的偶联物大约少3倍。偶联物的降低与UCB NKs的粘附分子（CD2，CD11a，CD18和CD54）相对较低的表达有关。

对UCB NK细胞杀伤能力较低的其他可能的机制解释包括相对较高的抑制性受体复合物的表达，包括CD94 / NKG2A和/或KIR。还有一些其他表面受体也可能通过静息UCB NK细胞来减少杀伤。例如，很大一部分UCB NK细胞，但不是PB NK细胞，表达糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（GITR）。最近使用PB-NK细胞的研究表明，可溶性GITR配体（从肿瘤细胞中脱落）显著减弱NK细胞毒性。

尽管普遍认为UBC-NK细胞比PB-NK具有更低细胞毒作用，但UCB NK细胞在细胞因子刺激后迅速获得细胞毒性，如研究表明UCB-NK细胞在IL-12或IL-15刺激后迅速表达CD54，分泌与PB-NK一样的穿孔素和颗粒酶。这些发现可能为UCB-NK细胞用于临床治疗奠定了理论基础。

  综上所述，UCB NK细胞与PB NK细胞既有相似之处，也有不同之处。有关表面表型，细胞因子产生和细胞毒性的研究数据支持UCB NK细胞与成人PB NK细胞不同的观点。虽然静息的UCB在杀伤中显示出较低的细胞毒性，但这可以通过细胞因子刺激迅速纠正。总体而言，UCB和PB-NK细胞之间的差异不能解释为一个简单的不成熟或者细胞毒性高低的问题。需要更多的研究才能清楚揭示这两个来源NK所处的环境及其功能之间的差异，才能为更好的临床转化这两种来源NK打下更好的基础。