单核/巨噬细胞流式解决方案

2022-10-24 10:50:00

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单核/巨噬细胞流式分析基础




单核细胞在脉管系统、骨髓和脾脏中循环，其在稳态下不增殖。一旦单核细胞迁移到外周组织，就会分化为树突状细胞或巨噬细胞。单核细胞的特征是可塑性和异质性，因为它可以快速调整其功能表型以响应变化的机体环境。巨噬细胞存在于大部分组织中，因此具有不同的功能，除了能启动对病原体的免疫反应和炎症反应，巨噬细胞还维持组织稳态以及组织的修复和重塑发挥作用。

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单核细胞流式分析方案




01
人外周血单核细胞亚群

经典型、中间型和非经典型。

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02
小鼠单核细胞亚群

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单核细胞的培养




可以从PBMC中通过阴选试剂盒分离较纯的、有活性的单核细胞。也可以用CD14、CD64和CD192作为人单核细胞的特异性标志物通过流式分选出单核细胞。
原代人单核细胞可以在体外培养，需要注意的是，在血清或M-CSF存在的5天内，培养的单核细胞将开始分化为巨噬细胞。单核细胞以粘附和非粘附细胞的混合形式生长，粘附细胞的比例取决于培养基和刺激因子。
除了原代单核细胞，人外周血单核细胞系THP-1也常用于对单核巨噬细胞系统的研究。

  • THP-1特别依赖细胞浓度，ATCC建议10E5~10E6/mL，细胞密度过低会导致培养不好。一般状态不好的THP-1在培养了3天后数量仍然不多，继续培养1~2天，培养基严重泛黄。


  • THP-1细胞适合在pH偏酸性环境下生长，而且对培养基变化非常敏感，所以不宜频繁换液，尽量使用相同酸碱度的1640培养基。THP-1细胞复苏成功有一定难度，建议冻存时密度大一些，复苏时用小培养瓶。





巨噬细胞流式分析方案




Panmarker：人CD68，小鼠F4/80

单核细胞、巨噬细胞（Kupffer细胞）、树突状细胞表型

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Guidelinesfor the use of flow cytometry and cell sorting in immunologicalstudies(second edition). Eur. J. Immunol. 2019. 49: 1457–1973




流式分析巨噬细胞的注意事项




巨噬细胞通常存在于组织中，所以分析巨噬细胞时，需要先处理组织，比如解剖、研磨、剪碎等，然后进行酶消化，制备单细胞悬液。此外，在最终上机检测前建议将样本过滤，以保证检测的准确性和避免堵管。


巨噬细胞的培养



分离的单核细胞可以使用特殊的分化培养基分化成巨噬细胞。使用生长因子GM-CSF和M-CSF可以使单核细胞分化成巨噬细胞。在1640培养基中刺激单核细胞，培养基中添加10%FCS和10ng/mLGM-CSF或10ng/mLM-CSF持续7天，能导致M1或M2极化。刺激后，细胞贴壁生长。
另外，可以用不同的细胞因子先后刺激单核细胞来获得M1和M2极化。用含10%FCS的1640培养基培养得到的细胞，随后用10ng/mLLPS处理24小时和50ng/mLIFN-γ以获得M1巨噬细胞或添加20ng/mLIL-4可获得M2/M2a巨噬细胞。用免疫复合物和IL-1或LPS处理能促进M2b活化，加入IL-10、TGF-β或糖皮质激素则能促进M2c活化。
若要获得THP-1来源的巨噬细胞，可以用PMA刺激6小时，诱导细胞分化为巨噬细胞。然后，在PMA继续存在的情况下，分别通过IFN-γ(20ng/ml)和LPS(100ng/ml)培养48小时以上，使其向M1极化，或者IL-4(20ng/ml)和IL-13(20ng/ml)培养48小时以上，使其向M2极化。