探索 mRNA 质量控制复合物合成致死作用，开辟癌症治疗新方向

近日，来自 AbbVie（北芝加哥）的研究人员 Vivian Prindle、Adam E. Richardson、Kimberly R. Sher 等在《Nature》杂志上发表了题为 “Synthetic lethality of mRNA quality control complexes in cancer” 的论文。该研究发现了 mRNA 质量控制途径中 PELO-HBS1L 与 SKI 复合物之间的新型合成致死相互作用，为癌症治疗提供了潜在的高价值治疗靶点，在癌症精准治疗领域具有重要意义。

一、研究背景

精准医学的发展依赖于对患者基因组及其相关脆弱性的深入理解。合成致死是一种精准治疗癌症的策略，即同时敲除两个单独非必需基因会导致细胞活力丧失。过去 15 年，合成致死癌症靶点发现方法取得了临床成果，如 PARP 抑制剂的成功应用，同时也推动了 WRN、USP14 等新一代治疗靶点进入临床。随着 CRISPR 技术和基因组分析技术的发展，结合大型数据集，为在不同遗传背景下识别更多合成致死靶点提供了契机。本研究旨在探索新型合成致死靶点，以进一步推动癌症治疗的发展。

二、研究材料和方法

（一）细胞系

研究使用了多种细胞系，包括 MDA-MB-231、NCI-H1299 等，这些细胞系分别购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）、莱布尼茨研究所（DSMZ）等机构，并通过短串联重复序列分析进行身份验证，确保无支原体污染。

（二）抗体

使用多种特异性抗体检测蛋白质丰度，如检测 PELO、HBS1L 等蛋白的抗体，这些抗体在 Simple Western 实验中按特定比例稀释使用，并通过 RNP CRISPR 敲除靶基因和 Simple Western 分析验证其有效性。

（三）动物实验

动物实验严格遵循 AbbVie 机构动物护理和使用委员会以及美国国立卫生研究院的相关指南，在经过认证的设施中进行。使用雌性 CB17-SCID、NSG、SCID-bg 小鼠进行肿瘤研究，根据肿瘤体积将小鼠随机分组，每组 8 只，小鼠在 6 - 8 周龄开始实验。

（四）关键技术路线

体内 CRISPR 筛选：构建双基因 CRISPR 文库，对 MDA-MB-231 和 NCI-H1299 细胞进行工程改造使其表达增强型 Cas12a，用定制的 sgRNA 文库转导细胞，筛选后将细胞接种到小鼠体内，待肿瘤生长到一定体积后收集肿瘤，进行 DNA 提取、PCR 和下一代测序分析。

验证 PELO 和 HBS1L 的依赖性：利用 CRISPR - Cas9 敲除技术，针对不同细胞系设计靶向 PELO、HBS1L 等基因的 sgRNA，以非必需基因 B2M 为阴性对照，以 RAN、RPA3 等必需基因和 ABCE1 为阳性对照，通过电穿孔将核糖核蛋白复合物（RNPs）导入细胞进行基因编辑。同时构建多西环素诱导的敲除模型，验证基因敲除效果。

构建和验证等基因模型：通过电穿孔 RNPs 靶向特定基因，在 NCI-H1299 细胞中构建 PELO、HBS1L 等基因的克隆敲除等基因模型，经筛选和验证获得单克隆群体。

RNA 和蛋白质分析：使用 RNAeasy 试剂盒提取 RNA，进行逆转录和定量 PCR 分析基因表达；提取蛋白质，通过 Simple Western 分析蛋白质丰度；利用免疫沉淀技术研究蛋白质之间的相互作用。

细胞增殖和功能分析：通过 CellTiter-Glo 2.0 细胞活力检测试剂盒评估细胞活力，使用 Incucyte 系统监测细胞融合度；利用高内涵分析和流式细胞术分析细胞周期、死亡和相关信号通路的变化。

三、研究结果

（一）PELO 是 9p21.3 缺失癌症的选择性依赖靶点

研究人员进行体内 CRISPR 筛选时发现，在 9p21.3 缺失的肿瘤模型中，PELO 和 IFNΒ1 出现独特的非同源缺失。进一步研究证实，在 MDA-MB-231 细胞中存在单基因 PELO 依赖性，而 NCI-H1299 细胞中则无。通过对 DepMap 模型分析发现，PELO 依赖性与 9p21.3 位点多个基因的低 RNA 表达密切相关，如 KLHL9、FOCAD 等。在多种 9p21.3 缺失的癌细胞系中，敲除 PELO 导致细胞活力显著丧失，而在正常细胞系中则无此现象。在体内实验中，利用 MIAPACA2 细胞构建的多西环素诱导敲除模型显示，敲除 PELO 可显著抑制肿瘤生长，验证了 PELO 是 9p21.3 缺失肿瘤的脆弱靶点。

（二）FOCAD 缺失决定 9p21 合成致死性

为确定与 PELO 存在合成致死相互作用的基因，研究人员构建了 NCI-H1299 PELO 敲除模型，并进行单引导 RNA（sgRNA）文库筛选。结果发现，在候选的 9p21.3 基因中，只有靶向 FOCAD 的 sgRNA 在 PELO 敲除背景下显著缺失，表明 FOCAD 缺失是决定 PELO 依赖性的合成致死伙伴。同时，研究还发现 SKIV2L 和 TTC37 在 NCI-H1299 PELO?/?细胞系中的显著性高于 FOCAD，且它们与 WDR61 共同构成 SKI 复合物（SKIc）。功能蛋白网络分析显示，FOCAD 在维持 SKIc 核心成员 SKIV2L 和 TTC37 的稳定性中起关键作用，FOCAD、SKIc 和 PELO 之间存在很强的遗传联系。

（三）SKIc 在癌症中缺失并驱动 PELO 依赖性

通过对 DepMap 数据的分析，发现 SKIV2L 和 TTC37 的低蛋白表达是 PELO 依赖性的重要预测指标，且它们的蛋白水平与 FOCAD 密切相关。在构建的多种 SKIc 等基因敲除模型中，均观察到 SKIc 非编辑成员的不稳定，核心酶蛋白 SKIV2L 和 TTC37 在所有敲除模型中均减少，FOCAD 和 AVEN 相互依赖。功能验证实验表明，敲除任何 SKIc 成员在 PELO 缺陷的 NCI-H1299 细胞中均表现出选择性抗增殖表型，而在野生型细胞中则无此现象。在 FOCAD 缺失的 MIAPACA2 细胞中，单独重新表达 FOCAD 才能完全挽救 PELO 依赖性，说明 SKIc 功能的发挥不仅仅依赖于核心解旋酶。此外，研究还发现除了 FOCAD（9p21.3）缺失，其他 SKIc 成员的突变或缺失也可能导致与 PELO 的合成致死关系，且 MSI-H 肿瘤中也存在 SKIc 不稳定和对 PELO 基因功能的依赖。

（四）PELO 和 SKIc 合成致死导致细胞周期停滞和未折叠蛋白反应

利用正交高内涵和流式细胞术分析发现，在 PELO 和 SKIc 同时缺失的条件下，细胞出现明显的 S 期塌陷，EdU 掺入显著减少。细胞周期在不同细胞系中出现不同阶段的停滞，NCI-H1299 细胞主要停滞在 G1 期，MDA-MB-231 细胞主要停滞在 G2 期。进一步分析发现，细胞早期未出现明显凋亡反应，后期部分细胞进入晚期凋亡。通过对 MIAPACA2 细胞敲除 PELO 后的转录组分析，发现 NF-κB、p53 和未折叠蛋白反应（UPR）通路相关基因显著上调。在多个模型中验证发现，诱导 PELO 和 SKIc 合成致死可导致 IRE1α、CHOP 和 pJNK 蛋白水平显著增加，且 IRE1α 活性增强，表明 PELO 和 SKIc 合成致死通过激活 IRE1α 引发 UPR 信号级联反应，影响细胞周期正常进展。

（五）HBS1L 是 SKIc 缺失癌症的合成致死靶点

基于酵母结构研究提示 HBS1L 可能与 PELO 协同发挥作用，研究人员对 HBS1L 进行研究。通过对 DepMap 数据的分析发现，HBS1L 依赖性与 9p21.3 基因表达和 SKIc 蛋白水平相关。在多种细胞系中敲除 HBS1L，在 SKIc 缺失的背景下观察到细胞生长受抑制，表明 HBS1L 是 SKIc 缺失模型中的另一个脆弱靶点。利用结构信息构建 HBS1L 突变体模型发现，HBS1L 的 GTPase 活性和与 PELO 相互作用的表面对于核糖体救援复合物的功能至关重要。体内实验显示，敲除 HBS1L 可导致 PELO 蛋白丢失和 pJNK 激活，抑制肿瘤生长，效果与敲除 PELO 相似，说明 PELO 通过 HBS1L 耗尽而失稳可能是导致抗增殖表型的原因。

四、研究结论

本研究发现了 PELO-HBS1L 核糖体救援复合物与参与 RNA 衰变的 SKIc 之间的新型合成致死相互作用。在不同遗传背景下，如 9p21.3 缺失和 MSI-H 肿瘤中，SKIc 的表型不稳定会导致肿瘤细胞对 PELO-HBS1L 核糖体救援复合物产生依赖。这种合成致死相互作用会改变正常细胞周期，通过激活 IRE1α 驱动未折叠蛋白反应，进而抑制肿瘤生长。PELO 和 HBS1L 有望成为针对 FOCAD（9p21.3）缺失、MSI-H 及其他导致 SKIc 不稳定的癌症的潜在高价值治疗靶点。

五、研究讨论

本研究揭示的 PELO-HBS1L 与 SKIc 之间的合成致死相互作用，类似于 PARP1 - PARP2 和 BRCA1 - BRCA2 等非同源合成致死关系，为癌症治疗提供了新的靶点和思路。然而，目前仍有一些问题需要进一步研究。例如，MSI-H 肿瘤中 SKIc 缺失的因果机制尚不明确；对于 SKIc 成员杂合缺失如何导致 SKIc 不稳定，以及这些模型是否存在杂合性缺失或其他影响因素还不清楚；SKIc 基因错义变异的功能后果也有待深入研究，这对于全面了解抑制 PELO-HBS1L 救援复合物的治疗潜力至关重要。此外，虽然大型研究项目已对众多癌细胞模型的转录组、基因组和依赖性进行了表征，但目前蛋白质组数据的局限性限制了对依赖性和蛋白质水平预测能力的提升。未来需要进一步拓展研究工具，获取更多癌细胞系的全蛋白质组数据，以推动合成致死靶点的研究和应用。本研究为癌症精准治疗开辟了新方向，后续研究将有助于进一步挖掘这些靶点的治疗潜力，为癌症患者带来新的希望。