在医学领域，缺血性中风是一个严重威胁人类健康的全球性难题。它来势汹汹，一旦发病，往往会给患者及其家庭带来沉重的打击。不过，随着科研人员的不断探索，一种新的治疗思路逐渐浮现——利用间充质干细胞衍生的上清液通过鼻内给药的方式治疗缺血性中风，这为众多患者带来了新的希望。
缺血性中风：亟待攻克的健康难题
缺血性中风，简单来说，就是由于脑部血管被堵塞，导致局部脑组织缺血缺氧，进而引发一系列严重的后果 。在临床上，目前主要的治疗方法是通过静脉溶栓或机械取栓来尽快恢复血管的通畅。然而，这些方法存在着诸多限制。治疗时间窗口非常狭窄，就像在和时间赛跑，一旦错过最佳治疗时机，效果就会大打折扣。而且，这些方法仅仅解决了血管再通的问题，对于急性缺血引发的其他病理生理机制，比如神经炎症反应，却无能为力 。
神经炎症反应在缺血性脑损伤的持续发展中扮演着关键角色。当脑部发生缺血时，免疫系统会被激活，各种免疫细胞如潮水般涌入受损区域。其中，中性粒细胞作为免疫系统的“先头部队”，在神经炎症反应中起着核心作用 。在正常情况下，中性粒细胞能够帮助身体抵御病原体的入侵。但在缺血性中风的情况下，它却变得“敌我不分”。大量中性粒细胞被招募到受损脑组织后，会释放出活性氧（ROS）、金属蛋白酶、穿孔素以及中性粒细胞胞外陷阱等物质 。这些物质就像一把把“双刃剑”，在试图清除病原体的同时，也对血脑屏障造成了严重的破坏，使得原本保护大脑的屏障变得千疮百孔，进一步加重了脑组织的损伤 。
近年来，随着研究的深入，人们发现中性粒细胞其实具有异质性，就像一支有着不同分工的部队，分为促炎的N1型和抗炎的N2型 。N1型中性粒细胞就像队伍中的“激进派”，会加剧炎症反应和脑损伤；而N2型中性粒细胞则像是“温和派”，能够抑制炎症，对神经修复起到积极的作用 。如何调节这两种亚型中性粒细胞的平衡，成为了治疗缺血性中风的一个新方向。越来越多的研究开始聚焦于这个领域，希望能够找到有效的方法，让“温和派”占据上风，从而减轻神经炎症反应，促进大脑的修复 。
传统治疗VS干细胞疗法
在过去的几十年里，干细胞疗法作为一种新兴的治疗手段，逐渐进入了人们的视野，并且在治疗缺血性中风方面展现出了一定的潜力 。干细胞就像是身体里的“万能细胞”，具有自我更新和分化的能力，能够分化成各种不同类型的细胞，还能分泌多种生物活性物质，对受损组织的修复和再生有着重要作用 。然而，干细胞疗法在实际应用中却面临着诸多挑战 。直接移植的干细胞在体内的归巢效率很低，就像迷失方向的小鸟，很难准确地到达受损的脑组织部位 。而且，干细胞调节中风后神经炎症的具体机制还没有完全明确，这就好比我们只知道它有治疗作用，但却不清楚它是如何发挥作用的 。此外，目前常用的干细胞给药途径，如静脉注射、动脉注射和颅内注射等，都存在着一些问题 。这些方法不仅移植效率低，还可能会对细胞的活力造成影响，甚至存在引发二次损伤和脑水肿的风险 。
为了充分发挥干细胞的抗炎潜力，哈尔滨医科大学基础医学院的科研人员把目光投向了干细胞的衍生物，比如富含蛋白质和功能性RNA的外泌体以及细胞外囊泡等 。这些衍生物在中风治疗方面展现出了一定的前景，但是它们也存在着一些局限性，比如所含的生物成分有限 。相比之下，干细胞分泌的上清液和细胞裂解物富含细胞内和细胞外的生物活性物质，理论上可能在减轻缺血性中风后的神经炎症反应方面具有更强的效果 。在给药途径方面，传统的注射方式存在诸多弊端，而鼻内给药作为一种非侵入性的给药途径，具有独特的优势。它可以绕过血脑屏障，直接将治疗药物输送到大脑，就像为药物开辟了一条直达目的地的“绿色通道” 。基于这些考虑，研究人员提出了一个大胆的设想：通过鼻内给予干细胞分泌的上清液和细胞裂解物，是否能够有效地调节神经炎症反应，改善缺血性中风的治疗效果呢？这一设想成为了本研究的核心问题，也为后续的研究指明了方向。
在这项研究中，科研人员将目光聚焦于人类脐带间充质干细胞（hMSCs）。他们从这些干细胞的培养液中提取了分泌上清液（hMSC-L）和细胞裂解物（hMSC-M），并通过鼻内给药的方式将它们输送到患有缺血性中风的小鼠体内，以此来探究其治疗效果 。
研究人员首先建立了小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，这是一种常用的模拟人类缺血性中风的实验模型 。在成功诱导中风后，他们将小鼠分成不同的组，分别通过鼻内（i.n.）、静脉（i.v.）和腹腔（i.p.）等不同途径给予hMSC-L或hMSC-M 。经过连续3天的治疗后，研究人员进行了一系列的检测。
通过TTC染色，他们发现所有给药途径都能显著减小小鼠的脑梗死体积，就像给受损的大脑带来了一场“及时雨”，缓解了脑组织的缺血状况 。用Longa评分评估小鼠的神经功能，结果显示，接受hMSC-L和hMSC-M治疗的小鼠，神经功能都有了明显的改善，原本因为中风而行动不便的小鼠，逐渐恢复了一些运动能力 。在角转弯测试和抬高身体摆动测试中，这些小鼠的运动功能也有了显著的恢复，它们不再像之前那样偏向一侧运动，而是能够更加协调地活动 。更令人惊喜的是，鼻内给药的效果与传统的静脉注射和腹腔注射效果相当，但鼻内给药具有非侵入性的优势，操作更加方便，这为临床治疗提供了一种更便捷、更安全的选择 。
鼻内给予 hMSC - L 和 hMSC - M 有效减小脑缺血小鼠的梗死体积
为了进一步探究不同浓度的治疗药物对中风治疗效果的影响，研究人员调整了hMSC-L和hMSC-M的浓度，分别设置了1mg/mL和2mg/mL两个浓度组，通过鼻内给药的方式对MCAO小鼠进行治疗 。TTC染色结果显示，高浓度的hMSC-L和hMSC-M能够更显著地减小脑缺血体积，就像更强力的“修复剂”，对受损的大脑组织起到更好的保护作用 。神经功能评分也表明，较高浓度的药物能够更有效地促进小鼠的神经功能恢复 。在病理检查中，研究人员发现，接受高浓度药物治疗的小鼠，其脑组织中的空泡化和核萎缩等病理变化明显减轻，神经元中的尼氏体数量也有所增加，这意味着神经元的功能得到了更好的保护和恢复 。综合这些结果，研究人员选择了2mg/mL的浓度进行后续的实验，因为这个浓度的治疗效果更为显著 。
接下来，研究人员深入探究了鼻内给予hMSC-L和hMSC-M对中风后免疫细胞浸润和神经炎症反应的影响 。通过流式细胞术分析，他们发现治疗后，巨噬细胞的浸润比例没有明显变化，但免疫调节性的CD4highCD11b+Ly6Chigh单核细胞比例下降，而促炎性的CD45highCD11b+Ly6Cint单核细胞比例显著增加 。特别值得注意的是，中性粒细胞在大脑中的浸润比例明显降低，尤其是在hMSC-M治疗组中，这种下降更为显著 。研究人员还发现，在治疗后，外周血和脾脏中的中性粒细胞比例下降，而骨髓中的中性粒细胞比例增加。这表明骨髓可能在努力补充外周减少的中性粒细胞，以维持身体的免疫平衡 。
研究人员还检测了缺血脑组织中关键促炎细胞因子的转录水平，发现IFN-γ、TNF-α和IL-1β等促炎细胞因子的转录水平显著降低，这说明hMSC-L和hMSC-M能够有效地减轻神经炎症反应 。主要中性粒细胞趋化因子CXCL1、CXCL2和CCL3的转录水平也明显下降，这进一步证明了它们对中性粒细胞活性和功能的调节作用 。这些结果表明，鼻内给予hMSC-L和hMSC-M可以通过调节中性粒细胞的活性和功能，有效地减轻MCAO小鼠的神经炎症反应 。
hMSCs 处理显著降低了大脑中 CD45highCD11b + Ly6G + 中性粒细胞的比例，且 hMSC - M 处理组下降更明显（**P hMSC - M vs MCAO < 0.01）。
在探究hMSC-L和hMSC-M对中性粒细胞极化的影响时，研究人员发现，尽管中性粒细胞的总体浸润减少，但N2亚型中性粒细胞（CD45highCD11b+Ly6G+CD206+）的比例在大脑中显著增加，尤其是在hMSC-M治疗组中 。在骨髓和外周血等外周免疫器官中，N2亚型中性粒细胞的比例却显著下降 。这表明hMSC-L和hMSC-M能够促进N2亚型中性粒细胞向大脑的迁移，从而在缺血脑组织中发挥抗炎和神经修复的作用 。研究人员还检测了不同中性粒细胞亚型分泌因子的表达水平，发现N1特异性酶NE、MPO和PADi4的表达明显降低，而N2亚型的特征因子TGF-β和IL-10的表达显著增加，这进一步证实了hMSC-L和hMSC-M能够促进N2中性粒细胞的极化 。
背后的分子机制：
PPAR-γ/STAT6/SOCS1通路的关键作用
为了深入了解hMSC-L和hMSC-M调节中性粒细胞极化的分子机制，研究人员把目光聚焦在了PPAR-γ/STAT6/SOCS1通路 。PPAR-γ是一种关键的转录因子，在细胞分化过程中发挥着重要作用 。它平时“居住”在细胞质中，当被激活时，会发生构象变化，与核转运蛋白结合，然后进入细胞核，启动下游基因的转录 。STAT6和SOCS1是与PPAR-γ功能相关的信号分子，它们在细胞生长、代谢、凋亡和炎症调节等多个过程中都扮演着重要角色 。
研究人员首先用不同的培养基组合处理从小鼠骨髓组织中提取的原代中性粒细胞，通过流式细胞术检测发现，与对照组相比，hMSC-L/M处理组中Ly6G+CD11bhigh和Ly6G+CD62L+中性粒细胞亚群的比例显著降低，CD11b和CD62L的平均荧光强度值也明显下降 。这表明hMSC-L/M可能抑制了中性粒细胞的促炎激活、迁移和黏附能力 。奇怪的是，在蛋白质水平检测时，研究人员发现单独用hMSC-L/M刺激并不能改变PPAR-γ的激活水平 。
为了进一步探究其中的奥秘，研究人员用佛波酯（PMA）激活中性粒细胞，然后再加入hMSC-L/M进行干预 。结果发现，PMA刺激增强了中性粒细胞中PPAR-γ的核转位和表达，而hMSC-L/M的干预进一步促进了PPAR-γ的激活和核转位，同时降低了其磷酸化水平 。当用T0070907抑制PPAR-γ时，hMSC-L/M诱导的PPAR-γ核转位被显著阻断，细胞质和总PPAR-γ的表达水平也降低了 。
在PMA刺激下，体外培养的中性粒细胞会向N1或N2表型极化 。加入hMSC-L和hMSC-M后，N2型中性粒细胞的比例显著增加，N1型中性粒细胞的比例明显下降 。而抑制PPAR-γ的表达则会使极化明显向N1表型偏移 。ELISA检测结果显示，hMSC-L/M刺激能显著上调N2中性粒细胞的特征分子IL-10和TGF-β的表达，抑制PPAR-γ的表达则会逆转这些趋势 。这一系列实验结果表明，PPAR-γ在hMSC-L/M介导的中性粒细胞极化中起着关键的调节作用 。
研究人员还通过体内和体外实验评估了hMSC-L和hMSC-M对PPAR-γ/STAT6/SOCS1信号通路的影响 。在体内实验中，与假手术组相比，MCAO组小鼠大脑中PPAR-γ/p-PPAR-γ/SOCS1/STAT6/p-STAT6通路的蛋白表达水平增加，而hMSC-L和hMSC-M治疗进一步增强了这些通路成分的表达 。体外实验也得到了类似的结果，hMSC-L和hMSC-M刺激能增加SOCS1和STAT6的蛋白表达水平，其中hMSC-M治疗组的激活作用更为明显 。抑制PPAR-γ的表达会显著下调SOCS1/STAT6通路的蛋白表达水平 。研究人员还发现，hMSC干预能够逆转PMA诱导的N1和N2标记物表达的变化，同时抑制PPAR-γ和STAT6会进一步上调N1标记物的表达，下调N2标记物的表达 。这些结果表明，hMSC分泌的细胞因子可能通过PPAR-γ驱动的STAT6/p-STAT6/SOCS1信号通路，促进N2型中性粒细胞的重编程，抑制N1型中性粒细胞的极化 。
ELISA 分析 N2 型中性粒细胞中 IL - 10 和 TGF - β 的分泌水平，hMSCs 刺激显著上调这些抗炎因子表达（P < 0.001），抑制 PPAR - γ 则逆转该趋势。
改善血脑屏障与促进血管生成
血脑屏障在大脑的正常功能维持中起着至关重要的作用，它就像一道坚固的“城墙”，保护着大脑免受外界有害物质的入侵 。在缺血性中风发生后，血脑屏障会受到严重的破坏，变得不再那么坚固，导致免疫细胞和有害物质趁机进入大脑，加重脑组织的损伤 。研究人员想知道，hMSC-L和hMSC-M是否能够对受损的血脑屏障起到修复作用呢？
通过免疫荧光分析，研究人员发现，经过hMSC-L和hMSC-M治疗后，小鼠大脑中紧密连接相关蛋白occludin和ZO-1的表达显著增强 。这就好比是给受损的“城墙”进行了加固，使得血脑屏障的紧密性得到了恢复，能够更好地阻挡有害物质的进入 。治疗组中内皮细胞标记物CD31的表达也明显上调，这意味着在hMSC-L和hMSC-M的作用下，大脑中的血管生成增加了 。新生成的血管就像一条条“生命通道”，能够为受损的脑组织提供更多的氧气和营养物质，促进脑组织的修复和再生 。这些结果表明，hMSC衍生的分泌上清液能够促进血脑屏障的修复和血管再生，为大脑的恢复创造更好的条件 。
研究意义与展望
这项研究首次揭示了鼻内给予hMSC-L和hMSC-M可以通过激活PPAR-γ介导的SOCS1/STAT6/p-STAT6通路，促进中性粒细胞向N2表型重编程，从而减轻神经炎症反应和缺血性脑损伤 。这一发现为开发更方便、更安全、更有效的基于干细胞的中风治疗方法提供了全新的思路和理论依据 。鼻内给药这种非侵入性的方式，操作简单，避免了传统给药途径的诸多风险，有望成为未来临床治疗缺血性中风的一种重要选择 。
当然，目前的研究还存在一些局限性 。研究人员没有深入分析这些干细胞衍生物中的主要活性成分，这就好比我们虽然知道它们有治疗作用，但却不清楚具体是哪些“小能手”在发挥作用 。对于这些衍生物在中风模型中的长期疗效和安全性，也需要进一步的研究来评估 。在小鼠治疗后，外周免疫器官的细胞成分发生了显著变化，但研究中缺乏对鼻内给药后化合物的药代动力学和药效学的详细分析 。目前的研究也没有详细解释鼻内给予hMSC-L/M对中枢神经系统中其他主要细胞类型的影响和机制 。
展望未来，科研人员需要进一步深入研究hMSC-L和hMSC-M的具体成分和作用机制，明确其中起关键作用的生物活性物质 。通过更多的实验，评估它们在长期治疗中的效果和安全性，确保这种治疗方法在临床上的可行性和有效性 。研究人员还可以探索如何优化给药策略，比如确定最佳的给药剂量、给药时间间隔等，以进一步提高治疗效果 。相信在科研人员的不断努力下，基于间充质干细胞衍生上清液鼻内给药的治疗方法将不断完善，为缺血性中风患者带来更多的希望，让他们能够重新恢复健康，回归正常的生活 。
