在神秘的生命繁衍世界里，减数分裂（Meiosis）就像是一场精心编排的舞蹈，它是大多数有性生殖生物从二倍体祖细胞产生单倍体配子的基本生物学过程，是有性生殖的基础。而同源重组（Homologous recombination）则是这场舞蹈中最精彩的部分，它不仅增强了遗传多样性，还在减数分裂前期 I 为同源染色体之间建立起物理连接，确保染色体精确分离，维持物种染色体数目的稳定。

这一切的奇妙开端，都源于 DNA 双链断裂（DNA double-strand breaks，DSBs）的形成，它就像是舞蹈的起始信号。在大多数哺乳动物中，这个信号由 PRDM9 决定，而催化 DSB 形成的关键角色是 Spo11 蛋白。自 1997 年起，科学家们就知道 Spo11 在减数分裂 DSB 形成中起着关键作用，它属于 DNA 拓扑异构酶 VI（topo VI）家族。这个家族的成员是依赖 ATP/的异源四聚体 IIB 型拓扑异构酶，由两个 Top6A 和两个 Top6B 亚基组成。Spo11 与 Top6A 亚基有着广泛的同源性，而小鼠中与 Top6B 亚基对应的是 TOP6BL，它能与 SPO11 相互作用，二者形成的 SPO11-TOP6BL 复合物在体内对于减数分裂 DSB 的形成至关重要。

然而，在过去的 27 年里，尽管科学家们努力探索 Spo11 复合物的生化特性和结构，也取得了一些进展，比如确定了酵母 Spo11 核心复合物的冷冻电镜结构，但仍有一个关键问题没有解决：SPO11 复合物究竟是如何催化 DNA 断裂的，尤其是在哺乳动物中？这个问题就像一团迷雾，笼罩着减数分裂研究的领域。

为了拨开这团迷雾，中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所等单位的研究人员经过不懈努力，在《Nature》期刊上发表了题为 “In vitro reconstitution of meiotic DNA double-strand-break formation” 的论文。他们成功地在体外重建了减数分裂 DSB 的形成过程，为我们揭示了其中的奥秘，这一成果就像一束光照进了迷雾，为该领域的研究带来了新的方向 。

研究人员为了开展这项研究，用到了几个关键的技术方法。首先是蛋白质纯化技术，他们成功表达并纯化了带有不同标签的小鼠 SPO11 和 TOP6BL 蛋白，为后续研究提供了物质基础。其次是电泳迁移率变动分析（EMSA），用于研究 SPO11 与不同结构 DNA 的结合亲和力。还有 DNA 切割实验，评估哺乳动物 SPO11 的催化活性。此外，通过定点突变技术构建突变体，研究特定氨基酸残基对 SPO11 功能的影响，同时利用敲入小鼠模型验证关键位点在体内的作用。

小鼠 SPO11-TOP6BL 的生化特性

研究人员在研究 SPO11-TOP6BL 复合物时，遇到的第一个挑战就是纯化这些复合物。就像从一堆杂乱的拼图中找到正确的碎片一样困难，但他们成功克服了。通过使用 Expi293F 细胞，他们表达并纯化出了 N 端带有 His 标签的小鼠 SPO11（His-SPO11）和 C 端带有 Flag 标签的小鼠 TOP6BL（TOP6BL-Flag）蛋白。经过大小排阻色谱（SEC）分析，发现该复合物形成了一个 1:1 化学计量比的异源二聚体，这和之前认为的像祖先复合物 topo VI 那样的 2:2 排列不同。

为了进一步探究复合物的结构，研究人员进行了交联实验，就像是用胶水把拼图碎片固定住，看看它们是如何连接的。结果发现，除了异源二聚体，还存在潜在的异源四聚体。通过共免疫沉淀和下拉实验也证实了这一点，不过研究人员推测，在溶液中，异源二聚体可能更容易形成且更稳定。

复合物与 DNA 末端的高亲和力结合

接下来，研究人员想知道 SPO11 与不同结构的 DNA 结合能力如何。他们设计了五种具有不同末端结构的寡核苷酸，就像给 DNA 穿上了不同的 “衣服”，然后通过 EMSA 实验进行检测。结果发现，SPO11 对带有 5′突出端的结构具有更高的结合效率，这和酵母 Spo11 的结合模式是一致的。

体外重建减数分裂 DSB 形成

研究人员利用模仿 DSB 形成的基于质粒的底物，评估哺乳动物 SPO11 的催化活性。实验结果令人兴奋，His-SPO11 及其 MBP 融合变体都能有效地切割底物。时间进程实验表明，随着时间推移，超螺旋 DNA 逐渐被转化为线性质粒。

研究人员还发现，SPO11 通过类似拓扑异构酶的机制与 DNA 形成共价键，Y138 这个氨基酸残基在这个过程中起着不可或缺的作用。定点突变实验显示，Y138F 和 Y137F/Y138F 突变会完全消除活性，而 Y137F 突变则几乎保留了与野生型相同的活性。

进一步研究发现，SPO11 与切割后的 DNA 链末端形成共价键，并且特异性地结合在 DNA 链的 5′末端，这一过程就像给 DNA 的断裂末端贴上了一个特殊的 “标签”，模仿了体内 DSB 形成的过程。

切割位点的底物偏好

研究人员还想知道 SPO11-TOP6BL 复合物在切割 DNA 时，对序列有没有偏好。他们使用 END-seq 技术对切割位点进行定位，就像给 DNA 的切割位点做了一个 “定位导航”。结果发现，该复合物的切割位点存在轻微的序列偏好，在 pEBZSH 质粒 DNA 的切割位点中，+1 位置有胸腺嘧啶核苷酸偏好，-3 位置有鸟嘌呤核苷酸偏好。

SPO11 切割活性需要但不需要 ATP

通过结构分析，研究人员推测 SPO11 中的一些残基可能是离子的配位位点。实验结果证实了这一推测，和存在时，SPO11 表现出催化活性，而存在时活性则很低。而且，浓度对 SPO11 的活性有微妙的调节作用。

有趣的是，与 topo VI 不同，SPO11 的催化活性并不依赖 ATP。实验表明，增加 ATP 浓度反而会降低 SPO11 的活性，可能是因为 ATP 占据了的配位位点并竞争了 SPO11 与 DNA 的结合位点。

为了进一步验证结合对 SPO11 体外 DSB 形成活性的重要性，研究人员构建并纯化了三个突变体，结果发现这些突变体的质粒切割活性都显著降低。他们还构建了敲入小鼠模型，结果发现携带突变的小鼠，减数分裂在前期 I 早期就被阻滞，这进一步证实了结合残基在 SPO11 催化 DSB 形成中的关键作用。

综合这些研究结果，研究人员成功在体外重建了由 SPO11-TOP6BL 触发的减数分裂 DSB 形成过程。他们发现小鼠 SPO11-TOP6BL 的 DNA 切割活性需要通过 SPO11 中的 E224、D277 和 D279 残基与配位，但不依赖 ATP，这与祖先的 topo VI 酶不同。

这项研究成果具有重要的意义。它为我们理解减数分裂重组的第一步建立了一个机制框架，让我们对生命遗传信息的传递和变异有了更深入的认识。就像打开了一扇通往微观生命世界的新大门，里面藏着许多关于遗传奥秘的宝藏等待我们去挖掘。同时，也为后续研究 SPO11 和 TOP6BL 复合物诱导减数分裂 DSB 形成的结构细节，以及阐明其组件在二聚化和功能中的精确作用奠定了基础。未来，科学家们或许能基于这些研究成果，进一步探索遗传疾病与减数分裂异常之间的关系，为相关疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法 。

同期另外两篇文章分别介绍了SPO11 复合物的弱二聚化是它与拓扑异构酶 VI（topo VI）的关键区别；SPO11 二聚体体外催化 DNA 双链断裂，这些研究成果对深入理解减数分裂重组的调控机制具有重要意义，仿佛为我们打开了一扇通往细胞奥秘的新大门。